۲-۳-۲- تهیه نمونه‌های ماهی
ماهیان مورد نیاز مستقیما از صیدگاههای بندرهندیجان در همان لحظه صید تهیه شدند. جهت انجام این تحقیق۳۰ عددماهی هامور معمولی تازه صیدشده از صیدگاه سجافی بندرهندیجان صید گردیده و سپس ماهیان تهیه شده پس از شستشو در داخل جعبه های یونولیت حاوی یخ ( به صورت لایه های متناوبی از یخ و ماهی ) قرار داده شدند و سریعا به آزمایشگاه فارماکولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهیدچمران اهواز انتقال داده شدند. کنترل دمای داخل جعبه از طریق اندازه گیری مداوم دما به کمک دماسنج جیوه ای صورت گرفت ودر صورت ذوب شدن یخ های داخل جعبه وبا افزایش دمای جعبه ، یخ تازه به داخل جعبه اضافه می‌شد. مقدار یخ مورد استفاده بسته به نوع ماهی، فصل صید، فاصله از محل صید تا جایگاه تخلیه و کشتی متفاوت است. برای دستیابی به میزان سردسازی مناسب، می باید یخ به مقدار کافی در اطراف ماهی قرار داده شود. میزان متداول یخ به صورت قالب و خرد شده برای حمل ونقل و نگهداری ماهی در انگلستان یک قسمت یخ و سه قسمت ماهی است (فضل آرا، ۱۳۸۴). بنابراین نسبت۳ به ۱ ماهی هامور معمولی و یخ با اضافه کردن یخ به طور روزانه در کل دوره باید ثابت بماند در کل دوره، یخ به میزان کافی در دسترس بوده و جایگزین یخ ذوب‌شده می‌شد و در کف جعبه نیز جهت خروج آب حاصل از ذوب یخ یک سوراخ تعبیه شد تا آب حاصل از ذوب یخ خارج و در ظرف نگهداری باقی نماند، زیرا این آب علاوه بر آلوده‌بودن به خون و سایر ترشحات، دارای تعداد زیادی باکتریهای‌سرماگرا است که به آسانی در آنجا رشد و فعالیت خواهند داشت‌. تغییرات درجه‌حرارت باعث تغییرات در مقدار باکتری‌ها می‌شوند موقعی که ماهیان یخ‌گذاری می‌شوند طبقات ماهی و یخ بصورت یک درمیان می‌باشد و این طبقات یک در میان ممکن است شرایط بیولوژیک زندگی میکروب‌های ماهی را تغییردهد، بنابراین ضخامت لایه‌ها باید در حداقل ممکن بوده و در لایه‌ای که ماهی قرار دارد نیز یخ را به خوبی پخش کرده که این یخ پخش‌شده بین لایه‌ها علاوه بر بهترسردکردن، سبب بهبودکیفیت آن نیز می‌شود. در این حال باید دقت شود بین ماهی و جعبه تماس مستقیم وجود نداشته باشد. نمونه ها بصورت تصادفی از جامعه ماهیان صید شده می باشند ضمن اینکه مراحل اندیس های شیمیایی و انتخاب نمونه ها کاملا بصورت تصادفی انجام پذیرفت. با همین روند نمونه‌ها در فواصل زمانی صفر، ۳، ۶، ۹، ۱۲، ۱۵و ۱۸ روز مورد ارزیابی میکروبی و شیمیایی قرارگرفتند. در ابتدا قبل از هر گونه عملیات نگهداری، تعدادی ازماهیان صید شده انتخاب و آزمون میکروبیولوژیکی مورد نظر به همراه فاکتورهای شیمیایی در آنها مورد سنجش قرار گرفت. اینکار امکان مطالعه روند تغییرات فساد شیمیایی و میکروبی را در زمان های مختلف نگهداری میسر می سازد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۴- پارامترهای میکروبی و شیمیایی
۲-۴-۱- آزمون میکروبی
برای تعیین شمارش کلی میکروبی در این پروژه از کشت سطحی بر روی محیط آگار مغذی استفاده شد که شامل مراحل ذیل می باشد :
۲-۴-۱-۱- تهیه سرم فیزیولوژی
برای تهیه محلول سرم فیزیولوژی، ۹ گرم کلریدسدیم جامد به یک لیتر آب در یک بالن دو لیتری اضافه شد، سپس بر روی اجاق قرار گرفت و یک مگنت در داخل بالن قرار داده شد تا نمک به خوبی در آب حل شود، بعد از حل شدن، سرم فیزیولوژیک تهیه شده در در ارلن های ۹۰ سی سی و لوله های آزمایش تقسیم شده و درب آنها را با پنبه و ورق آلومنیومی محکم بسته و روی یکی از آنها چسب اتوکلاو زده، و در داخل اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۵/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه استریل شدند، بعد از استریل شدن جهت حل نمودن عضله چرخ شده (۹۰ سی سی به ازای ۱۰گرم عضله ماهی) مورد استفاده قرار گرفتند.
۲-۴-۱-۲- تهیه محیط کشت
برای تهیه محیط کشت، ۲۰ گرم نوترینت آگار شرکت مرک^[۵۳] بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده در یک لیتر آب مقطر حل شد و سپس بر روی اجاق حرارت دهی گردید، در زمان حرارت دادن در یک لحظه محلول شروع به جوشیدن نموده و کف می کند، در این زمان بایستی آن را از روی شعله برداشته و مدتی به حال خود رها کرده و مجدداً بر روی شعله قرار گرفت. این عمل سه بار تکرار می شود تا محیط کشت حالت آبکی پیدا نماید و در حالتی که حبابهای محیط کشت حالت لانه زنبوری گرفته و محیط شفاف می‌گردید عمل حرارت دادن خاتمه داده شد، سپس محلول حاصل در داخل ارلن ها ریخته شده و درب آنها را با پنبه بسته و ورق آلومنینیومی محکم بسته و در داخل اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۵/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه استریل شدند.
۲-۴-۱-۳- روش کشت
قبل از انجام هر گونه آزمون شیمیایی، نمونه ها در زمان های ذکر شده در بخش ۲-۱-۳-۱ جهت انجام آزمون میکروبی به آزمایشگاه بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران انتقال داده می شدند. ابتدا شعله ها را روشن نموده و کف هود و سینی مخصوص نگهداری ماهی با الکل ضد عفونی شدند، همچنین پوست ماهی از سمتی که عضله ماهی برش داده می شود به خوبی با الکل ضدعفونی شد. سپس عضله ماهی از قسمت جلویی (نزدیک سرپوش آبششی بین خط جانبی و قسمت پشتی) برش داده شد و ۱۰ گرم از عضله را در شرایط سترون با ترازو وزن نموده و در داخل هاون چینی کاملا همگون و یکنواخت گردید. سپس با ۹۰ سی سی سرم فیزیولوژی به خوبی مخلوط شد، در این حین لوله های آزمایش و پلیت ها را کدگذاری نموده و هر یک از رقت ها در لوله های آزمایشی که حاوی ۹ سی سی سرم فیزیولوژی استریل بودند تهیه شدند.
بر اساس روش APHA^[54] بعد از مراحل فوق به منظور تهیه رقتهای سریال از نمونه های مورد نظر مقدار یک سی سی از نمونه هموژن(مخلوط عضله ماهی با سرم فیزیولوژی) را از هاون (رقت ۱/۰) بوسیله سمپلر برداشته و به لوله آزمایش مورد نظر اضافه شد تا رقت ۰۱/۰ بدست آمد. مجددا از این لوله آزمایش (رقت ۰۱/۰) یک سی سی بوسیله سمپلر برداشته و به لوله آزمایش بعدی اضافه می شود تا رقت ۰۰۱/۰ تهیه شود. برای تهیه بقیه رقت ها نیز همین مراحل انجام می شود (استاندارد ملی ایران، شماره ۳۵۶). بایستی توجه داشت که برای تهیه هر رقت سرسمپلرها تعویض شود و کلیه مراحل در زیر هود و در مجاورت شعله و محیط استریل انجام شود. بعد از مراحل فوق پلت های حاوی محیط کشت با توجه به رقت مورد نظر شماره گذاری شدند و از هر رقت با سرسمپلر مخصوص خود ۱/۰ سی سی برداشته و در داخل پلیت مورد نظر ریخته شده و توسط لوله L شکل استریل محلول حاصل به خوبی بر روی محیط کشت پخش گردید. سپس پلیت های مذکور چند دقیقه به حال خود رها شدند تا محلول حاصل به خوبی بر روی محیط کشت ثابت شود، بعد کلیه پلیت ها را در داخل انکوباتور در دمای ۲۲ درجه سانتی گراد جهت انکوباسیون یا رشد باکتری های سرمادوست (استاندارد ملی ایرن، شماره ۲۶۲۹) و دمای ۳۷ درجه سانتی گراد جهت رشد باکتری های مزوفیل (استاندارد ملی ایران، شماره ۲۳۹۴) به مدت ۴۸ ساعت انکوبه می شوند و پس از ۴۸ ساعت، نمونه های کشت داده شده را از انکوباتورها خارج نموده و به وسیله پرگنه شمار، پرگنه های تشکیل شده در هر پلیت بطور جداگانه بر اساس روش شماره ۲۳۲۵ موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی مربوط به شمارش میکروارگانیسم ها شمارش شده و داده های بدست آمده، بصورت لگاریتم تعداد کلنی های شمارش شده به ازاء هر گرم (Log cfu/g ± SE) ارائه شدند. در این پروژه از ۵ رقت تا زمان پنجم نمونه برداری و سپس به دلیل افزایش رشد باکتری ها از رقت ششم نیز برای کشت استفاده گردید.
۲-۴-۲- اندازه گیری pH
برای اندازه گیری pH ، ابتدا ۵۰ سی سی آب مقطر را در یک بشر ۱۰۰ سی سی ریخته و روی شعله قرار داده شد تا کاملا به جوش بیاید، بعد آنرا را گذاشته تا به دمای محیط برسد. سپس ۱۰ گرم عضله ماهی را برداشته و در داخل هاون به خوبی چرخ نموده و ۵۰ سی سی آب مقطر جوشانده و خنک شده به آن اضافه نموده و به خوبی بهم زده شدند و با دستگاه pH متر، تغییرات pH در عضله در زمان های مورد نظر اندازه گیری شد.
۲-۴-۳- اندازه گیری تغییرات تری متیل آمین (TMA)
برای اندازه گیری تری متیل آمین از روش AOAC(1995) استفاده شد که ابتدا جهت تهیه عصاره بافت ماهی ۱۰ گرم از عضله ماهی وزن شد و با ۳۰ میلی لیتر از ماده تری کلرواستیک اسید ۵/۷ درصد مخلوط نموده و سپس با دستگاه هموژنیزر به مدت دو دقیقه یکنواخت گردید، تا محلول شیری رنگ حاصل شود. در مرحله بعد بافت یکنواخت شده در سرعت ۲۵۰۰ دور و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شده و مواد جامد ته نشین شده و محلول فوقانی که شفاف می باشد بعنوان عصاره بافت عضله ماهی مورد استفاده قرار گرفت.
آزمون TMA به روش زیر انجام شد:
ابتدا یک میلی لیتر از عصاره بافت ماهی با پیپت برداشته و به لوله آزمایش اضافه شد و با آب مقطر به حجم ۴ میلی لیتر رسانده شد، به عصاره فوق یک میلی لیتر فرمالدئید ۲۰% اضافه کرده و در مرحله بعد ۱۰ میلی لیتر تولوئن و ۳ میلی لیتر محلول کربنات پتاسیم به محتویات لوله آزمایش اضافه گردید تا حجم نهایی لوله آزمایش به ۱۸ میلی لیتر برسد. اکنون دو فاز در لوله آزمایش تشکیل شده است: فاز فوقانی تولوئن است وفاز زیرین سایر مواد موجود در لوله آزمایش است. نقش کربنات پتاسیم آزاد کردن ماده TMA موجود در عصاره بافت است و نقش تولوئن جذب کردن ماده TMA است‌‍‍، سپس درب لوله آزمایش را محکم بسته و در داخل بن ماری در حمام آب گرم ۳۰ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه قرار داده شد. بعد از گذشت ۵ دقیقه نمونه ها را از حمام آب گرم خارج وآن را بین ۴۰ تا ۶۰ بار تکان می دهیم به طوری که دو فاز تشکیل شده کاملاً با هم مخلوط شوند و TMA آزاد شده جذب تولوئن شود. به همین دلیل باید از لوله های آزمایشی استفاده شود که درب آنها محکم بسته شده و در هنگام تکان دادن هیچ مایعی خارج نشود . در مرحله بعد لوله ها را به مدت ۱۰ دقیقه در حرارت آزمایشگاه گذاشته تا دو فاز کاملاً از هم جدا شوند. پس از جداشدن فازها، ۹-۷ میلی لیتر لایه تولوئن را به دقت از لایه پایینی جدا نموده و به لوله آزمایش دیگر انتقال داده شد. اکنون جهت اینکه مطمئن شویم هیچ مولکول آبی در تولوئن نیست به لوله آزمایش، ۱/۰ گرم سولفات سدیم بدون آب انتقال نموده و در لوله کاملا بسته و به خوبی تکان داده شد تا تولوئن خشک گردد (آب آن گرفته شود)، سپس ۵ میلی لیتر محلول اسیدپیکریک به آن اضافه گردید و با چرخش آرامی کاملا با هم ترکیب نموده و با دستگاه اسپکتروفتومتر تغییر رنگ ایجاد شده مقابل لوله شاهد^[۵۵] که حاوی تمامی مواد نامبرده شده بجز عصاره ماهی است، در طول موج ۴۱۰ نانومتر قرائت شد
به منظور تهیه استانداردها به ترتیب ۱، ۲ و۳ میلی لیتر از محلول استاندارد TMA (working solution) با آب مقطر به حجم ۴ میلی لیتر رسانده شد، سپس با تعیین میزان جذب نور منحنی استاندارد رسم گردید. در این آزمایش یک لوله به عنوان شاهد نیز در نظر گرفته شد. جدول ۲-۲ میزان مواد و محلولهای هر سه لوله شاهد، استاندارد و مجهول را نشان می دهد
با تعیین میزان جذب نور در نمونه مجهول و با بهره گرفتن از منحنی استاندارد تهیه شده و رابطه ۲-۱ میزان TMA در هر ۱۰۰ گرم عضله ماهی محاسبه شد:
۳۰۰ * (ml) محلول استاندارد مصرف شده * (محلول استاندارد mg TMA-N/g) * (A/A’ ) = (بر پایه میلی‌لیتر) نمونه mg TMA-N/100g : رابطه ۲-۱
جدول ۲-۱- میزان محلولهای لازم جهت اندازه گیری تری متیل آمین برای هر آزمایش