اتیدیوم بروماید: (اتیدیوم بروماید آماده که توسط شرکت آریا طوس ساخته شده است.)
تانک الکتروفورز، پلیت و شانه ژل
تامین کننده جریان الکتریسیته
۳ـ۹ـ۲ـ تهیه ژل آگارز ۳ درصد:
برای تهیه ژل آگارز ۳ درصد مقدار ۴۵/۰ گرم از پودر آگارز را درml 15 از بافر TAE(1X) حل کرده روی حرارت قرار داده تا بجوشد و آگارز حل شود. (آگارز باید شفاف شود.) سپس باید صبر کرد تا دمای آن حدودا به ۵۰-۴۰ درجه سانتی گراد برسد. در مرحله بعد به آن ۳ میکرولیتر اتیدیوم بروماید اضافه شد. ژل را در ظرف مخصوص که حاوی شانه (برای ایجاد چاهک که بعدا محصولات PCR در آن ریخته می شود.) ریخته می شود تا سرد شده و کاملا ببندد و حالت ژله ای به خود بگیرد.
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
بعد از اتمام مدت زمان تعیین شده برای عمل آنزیم مورد نظر، محصولات را از انکوباتور خارج کرده و ژل آگارز از قبل آماده شده در دستگاه الکتروفورز، انتقال گردید. با سمپلر۱۰-۵/۰ به اندازه ۳ میکرولیتر در یکی از چاهک ها مارکر bp100 لود شد و در چاهک های دیگر ۱۰-۸ میکرولیتر از محصولات، لود می شود. سپس ولتاژ دستگاه ابتدا به مدت ۲ تا ۳ دقیقه روی ولتاژ ۱۰۰ قرار داده، و بعد آن را در ولتاژ۷۰ به مدت ۳۰ دقیقه قرار می دهیم. در نهایت ژل را از تانک خارج کرده و با بهره گرفتن از دستگاه Gel Document باند های حاصل شده توسط شناسایی و هضم آنزیم در محل های اختصاصی عکس برداری به عمل می آید و با مقایسه باندهای حاصل شده با باندهای حاصل از Ladder نتایج مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند.
۳ـ۱۰ـ بررسی پلی مورفیسم rs53576 ژن OXTR (SNP 2)
پلی مورفیسم rs53576 که محصول PCR آن bp 340 می باشد، مورد مطالعه قرار گرفته و امکان جهش در نوکلئوتید G، در بین بیماران اسکیزوفرنی و گروه کنترل مورد بررسی قرار می گیرد. بعد از انجام مرحله PCR نمونه ها تحت تاثیر آنزیم محدودگر BamHӀ قرار گرفت. این آنزیم جایگاه rs53576 را شناسایی می کند و نوکلئوتید A/G را در رشته ۵′-۳′ و ۳′-۵′ برش می زند.
| نام ژن | توالی نوکلئوتیدی | اندازه محصول PCR | آنزیم | اندازه محصول برشی |
| OXTR | Forward : ۵′-GCCCACCATGCTCTCCACATC -3′ |
bp 340 | BamH Ӏ | ۲۲۰-۱۲۰ A ۳۴۰G |
| OXTR | Reverse : ۵′-GCTGGACTCAGGAGGAATAGGGAC-3′ |
bp 340 | BamH Ӏ | ۲۲۰-۱۲۰ A ۳۴۰G |
جدول ۳-۶- مشخصات پرایمر برای جایگاه rs53576
روش کار پلی مورفیسم جایگاه rs53576 در کلیه مراحل مشابه پلی مورفیسم جایگاه rs2254298 بوده، که به دلیل متفاوت بودن آنزیم برای شناسایی جایگاه rs53576 شرایط انکوبه شدن و مدت زمان برای فعال شدن آنزیم متفاوت است.
۳ـ۱۰ـ۱ـ آنزیم BamHӀ
این آنزیم از E.coli منشا می گیرد.
عملکرد این آنزیم شناسایی و برش جایگاه۵̕ … G↓G A T C C … ۳̕ در واریانت ژنتیکی rs53576 می باشد.
C C T A G↑G…۵̕ ۳̕ …G
| وضعیت آللی | هوموزیگوت طبیعی (G/G) |
|
[دوشنبه 1400-09-15] [ 08:06:00 ب.ظ ]
|
